Una plataforma online para analizar datos biofísicos

Por Osvaldo Burastero (Especialista en Explotación de Datos y Descubrimiento del Conocimiento – UBA y Licenciado en Ciencias Biológicas – UBA).

En 2019 tuve la oportunidad de realizar una pasantía en el European Molecular Biology Laboratory (EMBL), Hamburgo, Alemania. Durante ese período trabajé en el grupo de la investigadora Maria Garcia Alai, junto con quien presentamos recientemente el proyecto “eSPC, una plataforma online para analizar datos biofísicos”. El mismo me permitió ser seleccionado para un programa de becas del EMBL (EMBL Technology Developers Programme | EMBL.org). Ubicado en la interfaz del análisis de datos y la biología estructural, la formación otorgada por la Maestría en Explotación de Datos y Descubrimiento del Conocimiento (UBA) fue clave para complementar mi formación de doctorado en el grupo del Dr. Adrian Turjanski y poder desarrollar el plan del proyecto.

Acerca del proyecto

Los procesos biológicos dependen de la formación de complejos tales como proteína-ligando y proteína-proteína. Estudiar la afinidad, la cinética, y la termodinámica de la unión entre estos pares es fundamental para comprender los mecanismos celulares básicos y desarrollar terapias con fármacos y anticuerpos. Existen varias tecnologías que brindan información acerca de la interacción entre biomoléculas, cada una basada en medir diferentes señales. Muchos usuarios carecen de la experiencia necesaria para evaluar la calidad de los datos adquiridos y realizar un análisis completo. Por eso, nos propusimos desarrollar eSPC, una plataforma con herramientas fáciles de usar para simular posibles resultados, evaluar y ajustar los datos experimentales. 

Tecnologías actuales

La cuantificación de interacciones biomoleculares y estabilidad de proteínas es una parte esencial de todo proyecto de investigación en biología molecular. Las técnicas biofísicas  incluyen la medición de una sorprendente variedad de señales tales como fluorescencia, calor, interferencia en un patrón de luz, entre otras. Una de ellas, llamada fluorescencia diferencial de barrido (DSF, differential scanning fluorimetry), consiste en medir la fluorescencia emitida en función de la temperatura. Si se detecta un cambio en la señal, se puede extraer información sobre el proceso de desnaturalización de la proteína. La fluorescencia puede ser emitida por los aminoácidos de la proteína o por un marcador que se une a los parches hidrofóbicos de la proteína a medida que se despliega (Niesen et al., 2007). En ambos casos, el principio subyacente es que las modificaciones en el entorno del fluoróforo se traducen en cambios de señal. 

Debido a que el DSF permite obtener la estabilidad de una proteína en diferentes condiciones, se puede utilizar para identificar condiciones óptimas o para seleccionar ligandos que estabilizan el estado plegado (Kotov et al., 2019) (Figura 1). 

Figura 1. Proteína en tres condiciones distintas. En el tubo de la derecha, la misma se encuentra totalmente desplegada. Ilustración creada por Silvia Burastero.

eSPC en acción

Disponible en https://spc.embl-hamburg.de, la plataforma ya contiene tres módulos para analizar datos experimentales. Dos basados en la técnica de DSF y otro basado en una técnica llamada termoforesis en microescala (MST, microscale thermophoresis). 

FoldAffinity, uno de los módulos de DSF, permite calcular afinidades de unión a partir de curvas de desplegado térmico. Brevemente, se incuba a la proteína con concentraciones crecientes de ligando y se mide, para cada concentración, la fluorescencia en función de la temperatura (Figura 2). Para analizar los datos, se ajustan primero (global o localmente) todas las curvas a una función que tiene como input la temperatura y output la fracción de proteína desplegada. Luego, se selecciona una temperatura donde el cambio en la fracción desplegada es significativo y se construye la curva de proteína desplegada versus concentración de ligando. Posteriormente, gracias a un modelo biofísico, se obtiene la afinidad de unión entre el ligando y la proteína.

Un video de FoldAffinity en funcionamiento se encuentra disponible aquí: 

Figura 2. Desplazamiento en la curva de desnaturalización debido a la unión de ligando. Ilustración creada por Silvia Burastero.

Implementación de la plataforma

El desarrollo de cada módulo sigue un flujo de trabajo similar. Se empieza por comprender las necesidades de los usuarios y se crea el primer prototipo que es testeado por el grupo de la Dra. Maria Garcia Alai (SPC group). Luego, sigue el testeo interno mediante la exposición a otros científicos del instituto. Finalmente, se pone el módulo a disposición de la comunidad biofísica. Para embarcarnos en este proyecto decidimos utilizar la herramienta Docker, que permite encapsular fácilmente el entorno y crear módulos autónomos. Hasta ahora, la interfaz de usuario de las aplicaciones fue programada en R gracias al paquete Shiny y los scripts de análisis se hicieron con código de Python o R. Por el momento, los dockers son servidos al usuario con la herramienta de R shinyproxy. 

Figura 3. Ciclo de implementación de los módulos de la plataforma eSPC.

Lanzamiento y perspectivas futuras

La plataforma está accesible en https://spc.embl-hamburg.de. Creemos que la misma va a ser adoptada por la comunidad biofísica debido a que 1) fue desarrollada pensando en el usuario, con una interfaz simple y con la capacidad de exportar figuras listas para ser incluidas en trabajos científicos, 2) es gratis, 3) está online así que no depende de ningún sistema operativo, y 4) ofrece algunos análisis no disponibles hasta ahora en ningún software. Actualmente estamos trabajando en la escritura de una publicación científica avalada por pares para difundir nuestra plataforma. 

El trabajo futuro durante la beca del EMBL (a partir de Octubre 2021) consiste en el desarrollo de nuevos módulos, incluyendo análisis con modelos más complejos (de técnicas tales como isothermal titration calorimetry)

 

Referencias

Niesen, F. H., Berglund, H., & Vedadi, M. (2007). The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nature protocols, 2(9), 2212.

Kotov, V., Mlynek, G., Vesper, O., Pletzer, M., Wald, J., Teixeira‐Duarte, C. M., … & Marlovits, T. C. (2021). In‐depth interrogation of protein thermal unfolding data with MoltenProt. Protein Science, 30(1), 201-217.

Niebling, S., Burastero, O., Bürgi, J., Günther, C., Defelipe, L. A., Sander, S., … & García-Alai, M. (2021). FoldAffinity: binding affinities from nDSF experiments. Scientific reports, 11(1), 1-17.

 

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